Desenvolvimento de novos vetores bem regulados para Escherichia coli
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Coorientador(es)
Membros da banca
Carvalho, Elen Bethleen de Souza
Mariuba, Luis Andre Morais
Procópio, Rudi Emerson de Lima
Silva, Carlos Gustavo Nunes da
Mariuba, Luis Andre Morais
Procópio, Rudi Emerson de Lima
Silva, Carlos Gustavo Nunes da
Pós-Graduação
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Universidade Federal do Amazonas
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Resumo
Neste trabalho foi construído um conjunto de vetores de expressão regulados para finalidades
de clonagem e expressão de genes heterólogos em Escherichia coli. Os promotores são
elementos essenciais dos cassetes de expressão utilizados nesse tipo vetores. Os vetores,
derivados desse trabalho, que expressam genes heterólogos em diferentes níveis e de forma
bem regulada foram baseados em um promotor sintético denominado de DM. A atividade do
promotor DM pode ser modulada tanto por IPTG como por glicose. Os plasmídeos
denominados: pDM02 (baixa cópia), pCDM (baixa cópia), pDMU01 (alta cópia) e pDMU02
(alta cópia) foram capazes de expressar em altos níveis e de maneira regulada em E. coli as
sequências gênicas da GFP (Green Fluorescent Protein), da tiorredoxina humana fusionada
com a enteroquinase bovina e do hormônio de crescimento de tambaqui. A sequência
promotora DM foi modificada por meio de síntese química randômica de DNA para a
construção de uma biblioteca de novos promotores sintéticos e estes foram a seguir ligados ao
vetor pCDM em posição adequada para expressar o gene repórter da GFP. Clones de E. coli
contendo plasmídeos recombinantes com diferentes promotores foram obtidos. Um grupo de
clones que possuem novas sequências promotoras mantiveram a regulação por glicose e
tiveram maiores níveis de expressão enquanto outro grupo de clones apresentou menor nível
de regulação por glicose, porém com níveis bem maiores de expressão de GFP. Os resultados
mostram que os novos promotores sintéticos podem ser utilizados para o desenvolvimento de
novos, potentes e regulados vetores de expressão para a expressão de genes heterólogos tanto
para fins de pesquisa como para bioindustriais.
Abstract
In this work, a set of regulated expression vectors was constructed for purposes of cloning and
expression of heterologous genes in Escherichia coli. Promoters are essential elements of the
expression cassettes used in this type of vectors. The vectors, derived from this work, which
express heterologous genes at different levels and in a well-regulated way were based on a
synthetic promoter called DM. DM promoter activity can be modulated by both IPTG and
glucose. The plasmids named: pDM02 (low copy), pCDM (low copy), pDMU01 (high copy)
and pDMU02 (high copy) were capable of expressing at high levels and in a regulated manner
in E. coli the gene sequences of GFP (Green Fluorescent Protein), human thioredoxin fused
with bovine enterokinase and tambaqui growth hormone. The DM promoter sequence was
modified by means of random chemical DNA synthesis to construct a library of new synthetic
promoters and these were then ligated into the pCDM vector in an appropriate position to
express the GFP reporter gene. E. coli clones containing recombinant plasmids with different
promoters were obtained. A group of clones that had new promoter sequences maintained
glucose regulation and had higher levels of expression, while another group of clones showed
a lower level of glucose regulation, but with much higher levels of GFP expression. The
results show that the new synthetic promoters can be used for the development of new, potent
and regulated expression vectors for the expression of heterologous genes for both research
and bioindustrial purposes.
Descrição
Termo controlado
Tambaqui (Peixe) - Crescimento; Hormônios - Regulação; Peixes - Crescimento
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS)
Citação
MOREIRA, Diego da Silva. Desenvolvimento de novos vetores bem regulados para Escherichia coli. 2023. 203 f.Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus (AM), 2023.
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