Expressão de uma mini proinsulina humana modificada em Pichia pastoris
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Orientador(es)
Coorientador(es)
Carmo, Edson Júnior do
Membros da banca
Xavier, Mauro Aparecido de Sousa
Carvalho, Elen Bethleen de Souza
Carvalho, Elen Bethleen de Souza
Pós-Graduação
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Universidade Federal do Amazonas
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Direito de acesso
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Resumo
Conforme os dados da Fundação Internacional da Diabetes (IDF, 2021) revelam, a
diabetes mellitus é uma epidemia onerosa, impactando 537 milhões de pessoas no
mundo, sendo responsável por 6.7 milhões de mortes por ano e gerando um custo
mundial de quase 1 trilhão de dólares em tratamento. Diante de números tão
alarmantes, torna-se necessário o desenvolvimento de novos tipos de insulina para
atender a crescente demanda e garantir saúde e bem estar aos afetados. Análogos
de Insulina recombinante tem se destacado como alternativas eficazes e populares a
formulações mais tradicionais, providenciando tratamentos mais personalizados e
flexíveis para cada paciente, adaptados às necessidades individuais de cada paciente.
Devido a isto este trabalho teve como objetivo a produção de uma proinsulina com
uma mini cadeia C e insulina derivada que combinaria características advindas da
modificação LisPro e uma ação prolongada devido às alterações presentes na insulina
glargina. Este trabalho teve início com o desenho In silico da sequência de interesse,
a verificação e avaliação da mesma por softwares de bioinformática, sua otimização
de códons para expressão em Pichia pastoris, seguida da síntese química. O gene de
interesse foi clonado no vetor de expressão pPIC9, sob o controle do promotor AOX,
inicialmente transformado em Escherichia coli STBL3 para amplificação do material
plasmidial para sua subsequente análise, digestão e integração no genoma de P.
pastoris GS115. A produção da miniproinsulina modificada foi realizada por meio de
indução em meio BMMY induzido com 1% metanol a cada 24 horas em frascos
agitados a 30°C, 180 RPM. A análise da miniproinsulina modificada de interesse foi
realizada em gel SDS-PAGE Tris-tricina, sua purificação ocorreu via cromatografia
IMAC e a verificação de sua identidade foi por dot-blotting e ELISA utilizando utilizando
anticorpos para a insulina/proinsulina. Tais resultados demonstraram que a
miniproinsulina modificada possui a massa molecular de 6.8KDa, conforme o previsto
in silico, e uma ação imune assim como reconhecida por anticorpos anti-
insulina/proinsulina. O trabalho demonstrou uma miniproinsulina recombinante
modificada a qual apresentou características físico-químicas condizentes às predições
in silico e, que em futuros estudos, após conversão em insulina modificada, será
analisada em relação às suas propriedades físico-químicas e fisiológicas.
Abstract
Data by the International Diabetes Foundation (IDF, 2021) demonstrates that diabetes
mellitus is a costly epidemic, with 537 million people affected worldwide, 6.7 million
deaths each year and with almost 1 trillion dollars spent in treatment around the globe.
Due to such worrying metrics, the development of new types of Insulin is necessary to
supply global demand and assure the health and wellbeing of those affected.
Analogues of recombinant insulin have shown to be efficient and popular alternatives
to more traditional variant forms of Insulin, providing flexible and custom treatment to
each patient, adapted to the individual needs of the patient. In relation to this, this works
has as an objective the production of a proinsulin with a mini C peptide chain and a
derivative insulin which combines the characteristics shown by the LisPro modification
and a long acting effect provided by the modifications shown in insulin glargine . This
work started with the In silico design of the protein, it’s testing and verification through
bioinformatics softwares then with its optimization for expression in Pichia pastoris
followed by its chemical synthesis. The gene was cloned under the control of the AOX
promoter on the expression vector pPIC9, which was initially transformed in
Escherichia coli STBL3 to amplify the plasmid DNA for it’s cloning, digestion and
integration in the genome of Pichia pastoris GS115. The production of the modified
miniproinsulin was done through the induction of BMMY media by 1% methanol at 24
hours intervals in erlenmeyers at 30°C, 180 RPM. The analysis of the protein was done
via an tris-tricine SDS-PAGE gel, it’s purification done through IMAC chromatography
and immunology validation was done through anti insulin/proinsulin specific antibody
via dot-blotting and ELISA. The results show that, as predicted in silico, the modified
miniproinsulin has a 6.8KDa molecular mass and an immune response in anti
insulin/proinsulin antibodies. This work shows a modified proinsulin analogue with a
physio-chemical profile matching in silico predictions, that in future works, will have its
physio-chemical properties and physiological response analyzed after conversion to a
modified insulin analogue.
Descrição
Palavras-chave
Termo controlado
Diabetes Mellitus - Pesquisa; Engenharia de Proteínas
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS)
Citação
CAMARGO, Gabriel Coutinho Borges. Expressão de uma mini proinsulina humana modificada em Pichia pastoris. 2025. 100 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus (AM), 2025.
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