Análise investigativa dos fatores de virulência de cepas selvagens de shigella SPP. in vivo e seu potencial inflamatório
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Mariúba, Luis André Morais
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Universidade Federal do Amazonas
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Resumo
Shigelose é uma disenteria bacilar causada pela Shigella, um patógeno
Gram negativo e intracelular. Um dos modelos animais mais comuns para avaliar a
resposta imune da Shigella é a infecção pulmonar em camundongos devido a fácil
manipulação e similaridade com as respostas intestinais. Neste estudo, nós
levantamos a hipótese de como cepas clínicas isoladas de pacientes com shigelose
possuem expressão de resposta imune diferencial quando comparados com cepas
padrões (M90T). Nossa principal proposta foi analisar quatro cepas de Shigella
clínicas com diferentes genes de virulência e a cepa padrão M90T quanto as
respostas imunes após invasão murina em 24 e 48h. Métodos: Cepas clínicas de
Shigella foram selecionadas pela presença de genes de virulência específicos por
PCR. Primers relacionados ao sistema imune foram desenvolvidos. As cepas
clínicas e a padrão foram submetidas à análise de expressão gênica pelo Fluidigm
(Bioamark Platform). Os resultados foram analisados em programa estatístico R.
Resultados: Nós agrupamos os mRNA em cinco grupos: Pró Inflamatórios
(CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflamatórios (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3),
Resposta Inata (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Resposta adaptativa (Th1-like, IFN-
γ, IL-17A e IL-17B) e Macrófago (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1, MHC-like 2). Como
principais resultados, todas as amostras clínicas demonstraram uma expressão
mRNA em 24h de infecção que foi gradativamente aumentado após 48h, enquanto a
cepa padrão M90T teve a regulação oposta com taxas de mRNA em 48h, sugerindo
grandes diferenças entre as respostas a cepas clínicas e a padrões bem
caracterizados. A cepa clínica #5 não alterou a expressão de mRNA em 24 e 48h
nos genes da resposta adaptativa, sugerindo baixas taxas de invasão e controle do
hospedeiro nas etapas iniciais da infecção. A cepa clínica #11 demonstrou alta
atividade macrofágica devido a maior expressão de IFN-γ e NOS. A cepa #14 e #27
demonstraram um possível potencial de proteção Th1 devido a alta expressão
mRNA para MHC-like II e Th1 quando comparado a outras cepas e o controle
positivo. A presença de alta expressão de IL-17 na cepa #27 relação com células
Th17. O potencial imunológico da cepa #27 pode ter relação com as enterotoxinas
(shET1A, shET1B e shET2). A presença do conjunto completos destas enterotoxinas
foi confirmado na cepa #27 por PCR. Conclusão: As diferenças entre cepas clínicas
e padrões foram evidentes neste estudo. Cepa clínica 27 parece ser uma ótima
candidata para estudos futuros e pode prover novas perspectivas para as diferenças
de invasão e resposta imune vista nos hospitais.
Abstract
Introduction: Shigellosis is a bacillary dysentery caused by Shigella, a gramnegative
intracellular human pathogen. One of most common animal models to
evaluate Shigella’s immune response is mice pulmonary infection due easy
manipulation and similar gut responses. At this study, we have hypothesized how
clinical strains isolated from Shigellosis patients had differential immune response
expression when compared to standards strains (M90T). Our main proposition was
analyze four clinical Shigella strains with distinct virulence genes and M90T immune
responses at murine invasion after 24 and 48h infection. Methods: Shigella Clinical
Strains were selected through presence of specific virulence genes by PCR. Primers
related to immune system were designed. Clinical strains and M90T Shigella were
submitted to expression at Fluidigm (Bioamark Platform). Results were analyzed in
statistical software R. Results: We grouped analyzed mRNA in five gene sets: Pro
Inflammatory (CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflammatory (TGF-β1, TGF-
β2 e TGF-β3), Innate Response (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Adaptive Response
(Th1-like, IFN-γ, IL-17A e IL-17B) and Macrophage (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1,
MHC-like 2). As main results, all clinical strains displayed a moderate mRNA
expression in 24h infection which gets higher in 48h, while M90T standard had
opposite regulation with lower mRNA rates in 48h infection, suggesting major
differences between well characterized standards and clinical strains. Clinical strain
#5 did not alter mRNA expression in 24 and 48h at adaptive immune response
genes, suggesting low invasion rates and host control at initial steps of infection.
Clinical strain #11 demonstrates high macrophage activity by superior expression
levels of IFN-γ and NOS. Strains #14 and #27 suggest potential of Th1 protection
through high MHC-like II and Th1 mRNA expression when compared to all other
strains and standard control. Presence of IL-17 high expression in strain #27
demonstrates a possible relation with Th17 cells. The immunological potential of
strain #27 may have relationship with Shigella enterotoxins (shET1A, shET1B, and
shET2). Enterotoxins presence was confirmed by PCR and results shows this
complete set is absent in all other strains studied. Conclusion: The differences
between clinical strains and standards were evident at this study. Clinical strain 27
appears as a great candidate to future studies and may provide new perspectives
about differences among invasion and immune response seen in the clinical practice.
Descrição
Palavras-chave
Termo controlado
Shigella; Cepa Clínica; Shigelose; Resposta Imune; Shigella; Clinical Strains; Immune Response
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS)
Citação
SERRA, Paula Taquita. Análise investigativa dos fatores de virulência de cepas selvagens de shigella SPP. in vivo e seu potencial inflamatório. 2013. 106 f. Dissertação (Mestrado em Imunologia Básica e Aplicada) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2013.
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