Produção, purificação e caracterização bioquímica de Pleurotus pulmonarius (Pleurotaceae)
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Nascimento, Tiago Pajeu
Souza, João Vicente Braga
Souza, João Vicente Braga
Pós-Graduação
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Universidade Federal do Amazonas
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Resumo
Dentre as doenças cardiovasculares (DCV), a trombose representa 30% dos
70% dos óbitos globais e são oriundas da formação e/ou desenvolvimento de
coágulos sanguíneos em veias e artérias pelo acumulo de fibrina. As proteases com
ação fibrinolítica dissolvem os coágulos mediante a ativação da plasmina. Dentre
as mais variadas fontes de obtenção destas enzimas, os cogumelos comestíveis
pertencentes ao gênero Pleurotus sp. se destacam como produtores de enzimas
com potencial biotecnológico. O objetivo desse trabalho consistiu, inicialmente, em
detectar e quantificar, dentre diferentes meios e métodos de cultivo, a produção de
proteases fibrinolíticas, avaliar o nível de citotoxidade dos extratos obtidos, purificar
e determinar o tamanho molecular e caracterizar bioquimicamente o extrato
selecionado. Para tal, quatro resíduos de frutas amazônicas, três produtos
alimentares e três meios de cultivo sintéticos foram utilizados para obtenção das
proteases. Em todos os substratos avaliados foi detectado a produção de proteases
com ação fibrinolíticas. Os meios de cultivo com maior teor de atividade fibrinolítica,
foram: o resíduo borra de café – PPBB, 97,71 U/mL, o farelo de aveia - PPFA,
168,31 U/mL e o meio de cultivo sintético Extrato de Malte – PPEM, 173,20 U/mL.
Em seguida, todos os extratos de P. pulmonarius foram submetidos a análise de
toxicidade utilizando células de linhagens de fibroblastos humano (MRC-5) por 72
horas. Dentre os 10 substratos analisados, 2 substratos apresentaram alterações
morfológicas quando comparadas ao controle negativo (DMSO). PPEM foi, então,
liofilizado e semipurificado. Das 21 frações coletadas, a fração 1G11 apresentou
maior atividade proteolítica e fibrinolítica específica. Esta fração foi então, reinjetada
em sistema AKTA Avant sob as mesmas condições iniciais, obtendo um único pico
ativo com 51% de recuperação de proteases e 5,94 vezes de purificação (atividade
específica de 70,24 U / mL). Nas condições experimentais utilizadas, esta fração
apresentou duas bandas distintas com peso molecular de 48 e 63 KDa,
respectivamente, via SDS-PAGE, sugerindo fração enzimática homogênea sob
condições não redutoras, apresentou atividade ótima em pH 8,0, a 50 °C, sendo
classificada como metaloprotease, zinco e cálcio dependente e inibição parcial da
atividade na presença de metanol, isopropanol, acetona, butanol, acetonitrila,
DMSO, Triton X 100 e CTAB. A ação destes biocatalisadores foi inibida pela
presença de Fe+2. Desta forma foi possível concluir que a espécie de cogumelo
comestível P. pulmonarius produziu proteases com ação fibrinolítica em ambos os
métodos de cultivo avaliados demostrando o potencial biotecnológico desta espécie
de cogumelo na produção de proteases com ação fibrinolítica.
Palavras-chave: Trombose, resíduos, meios de cultivo, proteases.
Abstract
Among cardiovascular diseases (CVD), thrombosis accounts for 30% of
70% of global deaths and is caused by the formation and/or development of blood
clots in veins and arteries due to the accumulation of fibrin. Fibrinolytic proteases
dissolve clots by activating plasmin. Among the most varied sources of obtaining
these enzymes, edible mushrooms belonging to the genus Pleurotus sp. stand out
as producers of enzymes with biotechnological potential. The objective of this study
was initially to detect and quantify, among different culture media and methods, the
production of fibrinolytic proteases, evaluate the level of cytotoxicity of the extracts
obtained, purify and determine the molecular size and characterize biochemically
the selected extract. For this purpose, four Amazonian fruit residues, three food
products and three synthetic culture media were used to obtain the proteases. In all
substrates evaluated, the production of proteases with fibrinolytic action was
detected. The culture media with the highest fibrinolytic activity content were: coffee
grounds residue - PPBB, 97.71 U/mL, oat bran - PPFA, 168.31 U/mL and the
synthetic culture medium Malt Extract - PPEM, 173.20 U/mL. Then, all P.
pulmonarius extracts were subjected to toxicity analysis using human fibroblast cell
lines (MRC-5) for 72 hours. Among the 10 substrates analyzed, 2 substrates
presented morphological alterations when compared to the negative control
(DMSO). PPEM was then lyophilized and semipurified. Of the 21 fractions collected,
fraction 1G11 presented the highest specific proteolytic and fibrinolytic activity. This
fraction was then reinjected into the AKTA Avant system under the same initial
conditions, obtaining a single active peak with 51% protease recovery and 5.94-fold
purification (specific activity of 70.24 U/mL). Under the experimental conditions
used, this fraction presented two distinct bands with molecular weights of 48 and 63
KDa, respectively, via SDS-PAGE, suggesting a homogeneous enzymatic fraction
under non-reducing conditions, presenting optimal activity at pH 8.0, at 50 °C, being
classified as metalloprotease, zinc and calcium dependent and partial inhibition of
activity in the presence of methanol, isopropanol, acetone, butanol, acetonitrile,
DMSO, Triton X 100 and CTAB. The action of these biocatalysts was inhibited by
the presence of Fe+2. Thus, it was possible to conclude that the edible mushroom
species P. pulmonarius produced proteases with fibrinolytic action in both cultivation
methods evaluated, demonstrating the biotechnological potential of this mushroom
species in the production of proteases with fibrinolytic action.
Keywords: Thrombosis, residues, culture media, proteases.
Descrição
Palavras-chave
Termo controlado
Cogumelos comestíveis - Meios de cultivo; Sistema cardiovascular - Doenças
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS)
Citação
ROZARIO, Roberto Bentes. Produção, purificação e caracterização bioquimica de Pleurotus pulmonarius (Pleurotaceae). 2025. 55 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus (AM), 2025.
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