Diagnóstico de Esporotricose: Reações de Detecção (PCR) e Diferenciação (PCR- RFLP) de Espécies de Sporothrix spp.
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Fernandes, Flávia da Silva
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Gomes, Waldireny Rocha
Cruz, Kátia Santana
Cruz, Kátia Santana
Pós-Graduação
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Universidade Federal do Amazonas
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Direito de acesso
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Resumo
A esporotricose é uma micose subcutânea emergente de relevância na região Amazônica, com
aumento expressivo de casos em humanos e felinos. A identificação rápida e precisa dos agentes
etiológicos é essencial para o manejo clínico e a vigilância epidemiológica. Este estudo teve
como objetivo aprimorar o diagnóstico molecular da esporotricose, avaliando diferentes
métodos de extração de DNA e comparando a sensibilidade de três regiões-alvo do DNA
ribossomal (ITS, ITS/LSU e D1/D2 do 28S) para amplificação por PCR. Três protocolos de
extração de DNA (fenol-clorofórmio, colunas de sílica e precipitação por sal) foram aplicados
a isolados de Sporothrix brasiliensis, S. schenckii, um isolado regional de Sporothrix spp., além
de Candida albicans e Aspergillus niger como controles externos. O método de fenol-
clorofórmio apresentou maior rendimento e pureza de DNA. Os primers ITS1–ITS4 foram os
mais sensíveis, detectando até 0,0002 ng de DNA, seguidos por NL1–NL4 (0,002 ng) e ITS5–
NL4 (0,02 ng). Uma análise in silico avaliou cinco enzimas de restrição (HaeIII, MspI, HinfI,
DdeI e RsaI), mas os perfis de fragmentação gerados pelas diferentes espécies de Sporothrix
apresentaram tamanhos muito semelhantes, com diferenças menores que 20 pb, dificultando a
diferenciação prática por PCR-RFLP. Experimentalmente, a PCR-RFLP permitiu distinguir os
isolados de Sporothrix dos fungos não relacionados (C. albicans e A. niger), mas não foi eficaz
para diferenciar entre S. brasiliensis e S. schenckii. A análise filogenética baseada na região ITS
confirmou que todos os isolados clínicos de Manaus pertenciam ao clado de S. brasiliensis.
Conclui-se que a combinação da extração por fenol-clorofórmio e PCR com primers ITS1–
ITS4 representa uma alternativa sensível e acessível para o diagnóstico da esporotricose na
região Amazônica.
Abstract
Sporotrichosis is an emerging subcutaneous mycosis of significant relevance in the
Amazon region, with a marked increase in cases among humans and felines. Rapid and accurate
identification of the etiological agents is essential for clinical management and epidemiological
surveillance. This study aimed to enhance the molecular diagnosis of sporotrichosis by
evaluating different DNA extraction methods and comparing the sensitivity of three target
regions of ribosomal DNA (ITS, ITS/LSU, and D1/D2 of 28S) for PCR amplification.
Three DNA extraction protocols (phenol-chloroform, silica columns, and salt
precipitation) were applied to isolates of Sporothrix brasiliensis, S. schenckii, a regional isolate
of Sporothrix spp., as well as Candida albicans and Aspergillus niger as external controls. The
phenol-chloroform method yielded the highest DNA yield and purity. The primers ITS1–ITS4
were the most sensitive, detecting as little as 0.0002 ng of DNA, followed by NL1–NL4 (0.002
ng) and ITS5–NL4 (0.02 ng).
An in silico analysis evaluated five restriction enzymes (HaeIII, MspI, HinfI, DdeI, and
RsaI), but the fragmentation profiles generated by the different Sporothrix species showed very
similar sizes, with differences of less than 20 bp, making practical differentiation by PCR-RFLP
challenging. Experimentally, PCR-RFLP allowed for the distinction of Sporothrix isolates from
unrelated fungi (C. albicans and A. niger), but it was not effective in differentiating between S.
brasiliensis and S. schenckii. Phylogenetic analysis based on the ITS region confirmed that all
clinical isolates from Manaus belonged to the S. brasiliensis clade. It is concluded that the
combination of phenol-chloroform extraction and PCR with ITS1–ITS4 primers represents a
sensitive and accessible alternative for the diagnosis of sporotrichosis in the Amazon region.
Descrição
Palavras-chave
Termo controlado
Biologia molecular; Micose - Pesquisa; DNA - Análise
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS)
Citação
ALMEIDA, Danielle Barreto de. Diagnóstico de Esporotricose: Reações de Detecção (PCR) e Diferenciação (PCR- RFLP) de Espécies de Sporothrix spp. 2025. 70 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus (AM), 2025.
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