Clonagem, expressão e caracterização de lisozima de Anopheles darlingi em Pichia pastoris
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Orientador(es)
Coorientador(es)
Carmo, Edson Junior do
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Carvalho, Sonia Maria da Silva
Cordeiro, Isabelle Bezerra
Cordeiro, Isabelle Bezerra
Pós-Graduação
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Universidade Federal do Amazonas
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Resumo
Desde a sua descoberta em 1922 por Alexander Fleming, a lisozima tornou-se um dos modelos enzimáticos mais estudados, devido ao seu mecanismo de ação como barreira natural de defesa contra microrganismos, especialmente bactérias gram-positivas. Na natureza, a lisozima é dividida em 6 tipos: tipo C, tipo G, tipo I, fúngico e bacteriano, fagos e plantas com características diferenciadas. Esta pesquisa tem como objetivo clonar e expressar a lisozima de Anopheles darlingi na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para este fim, uma cassete de expressão foi montado para inserção do gene da lisozima sintética de Anopheles darlingi no genoma da Pichia pastoris usando o vector de expressão pPIC9, confirmado por análise de restrição com as enzimas EcoRI e NotI. O cassete de expressão foi introduzida em P. pastoris por eletroporação, e 40 clones resultantes da transformação foram selecionados em meio mínimo sem aminoácidos. A técnica de imunodetecção cromogênica Western Breeze confirmou 39 clones recombinantes produtores de lisozima detectando a cauda de histidina presente na porção C-terminal no gene da lisozima. O uso do promotor AOX1 na cassete de expressão permitiu a indução dos clones recombinantes com metanol a 1% por 96 horas em fermentação submersa e a confirmação da expressão da proteína foi realizada pela análise eletroforética em gel de poliacrilamida em condição desnaturante SDS-PAGE 15% onde a presença da lisozima foi detectada em aproximadamente 14 kDa. A caracterização da enzima mostrou que a lisozima de A. darlingi possui aspectos distintos em relação a lisozima do ovo de galinha. Os resultados obtidos demonstram a capacidade que a levedura Pichia pastoris possui de expressar a lisozima e demonstram a agregação de potencial biotecnológico a esta pesquisa.
Abstract
Since its discovery in 1922 by Alexander Fleming, lysozyme has become one of the most studied enzymatic models, due to its mechanism of action as a natural defense barrier against microorganisms, especially gram-positive bacteria. In nature, lysozyme is divided into 6 types: type C, type G, type I, fungal and bacterial, phages and plants. This research aims to clone and express the lysozyme of Anopheles darlingi in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. To this end, an expression cassette was assembled for insertion of the synthetic lysozyme gene of Anopheles darlingi into the Pichia pastoris genome using the pPIC9 expression vector, confirmed by restriction analysis with the EcoRI and NotI enzymes. The expression cassette was introduced into P. pastoris by electroporation, and 40 clones resulting from the transformation were screened in minimal medium lacking amino acids. The Western Breeze chromogenic immunodetection technique confirmed 39 recombinant lysozyme-producing clones detecting the histidine tail present in the C-terminal portion in the lysozyme gene. The use of the AOX1 promoter in the expression cassette allowed the induction of the recombinant clones with 1% methanol for 96 hours in submerged fermentation and the confirmation of protein expression was performed by the electrophoretic analysis in polyacrylamide gel in denaturing condition SDS-PAGE 15% where the presence of lysozyme was detected at approximately 14 kDa. The characterization of the enzyme showed that A. darlingi lysozyme has distinct aspects regarding chicken egg lysozyme. The results obtained demonstrate the ability of Pichia pastoris yeast to express lysozyme and demonstrate the possible biotechnological potential aggregation to this research.
Descrição
Palavras-chave
Termo controlado
Enzimas; Anófele; Levedura (Fungos); Bactericidas
Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS)
Citação
SILVA, Samanta Gabriela Souza da. Clonagem, expressão e caracterização de lisozima de Anopheles darlingi em Pichia pastoris. 2019. 69 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2019.
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